Lineas de Investigación

Mecanismos de Hepatotoxicidad.

Metabolismo de fármacos en hígado  (tioacetamida, cocaína, ciclosporina).

L1

Hígados de rata. A la izquierda hígado control; en el centro, hígado después de tratamiento con tioacetamida 30 días; a la derecha, hígado tratado con tioacetamida 60 días.(Cascales 1987)

Hepatopatías agudas y crónicas in vivo

L2 

Hepatopatía aguda

(A) Necrosis perivenosa en hígado de ratón, inducida por cocaína.

(B) Necrosis periportal en hígado de ratón pretratado con fenobarbital,  inducida por cocaína (naranja de acridina) Cascales et al., 2001

 L3

Hepatopatía crónica

Nódulos hiperplásicos en hígado de rata producidos por la administración de tioacetamid adurante 60 días (Sanz et al., 1996)

Aislamiento y cultivo de hepatocitos de rata

 L4

Hepatocitos de rata en cultivo (Andrés et al., 2000)

Sistemas de destoxificación hepáticos:

monooxigenasas microsómicas dependientes de flavina y

del citocromo P-450.

Sistemas implicados la defensa celular antioxidante:

superóxido dismutasa, catalasa y glutation peroxidasa.

Sistemas generadores de NADPH: glutation reductasa,

glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, enzima málico, etc.

Generación de Especies Reactivas de Oxígeno

 (ROS) y radicales libres en la biotransformación de agentes hepatotóxicos

 L5

Hepatocitos de rata en cultivo tratados con hidroetidio, donde se observa, por microscopía confocal,  la producción del radical superóxido (rojo) en el interior de las células,  inducida por ciclosporina.  (Andrés et al.,  1997)

 L6

Hepatocitos de rata en cultivo tratados con diclorofluoresceína, donde se observa, por microscopía confocal,  la producción de peróxidos  (verde) en el interior de las células,  inducida por ciclosporina.

 ( Andrés et al.,  1997)

 

 L7

Hepatocitos de rata tratados con cocaína (0, 50, 500, 1000 µM) durante 24 horas y con yoduro de propidio y diacetato de diclorofluoresceína durante 30 minutos (Zaragoza et al., 1997)

 

Necrosis hepatocelular  perivenosa.

Morfología a microscopio óptico

L8

Necrosis perivenosa en hígado de rata,  a las 24 horas de la administración de una dosis subletal de tioacetamida (hematoxilina y eosina)(Sanz et al., 1996)

L9

Necrosis perivenosa en hígado de rata, pretratada con fenobarbital,  a las 24 horas de la administración de una dosis subletal de tioacetamida (hematoxilina y eosina)

Dolores Sarrión Tesis Doctoral, 1996

 

Necrosis hepatocelular perivenosa y periportal

Morfología a microscopio óptico

L10

A: lesión perivenosa obtenida por administración de cocaína intraperitoneal a ratas

B: lesión periportal obtenida por administración de cocaína intraperitoneal a ratas pretratadas con fenobarbital.

 

Parámetros de lesión hepática: enzimas en suero, bilirrubina, estrés oxidativo en hígado (TBARS, GSH/GSSG, proteínas-SH, etc  ),

Apoptosis (población hipodiploide, fragmentación del DNA, citocromo c, actividad caspasas, etc) Microscopía confocal Hoechst 33258.

L11

Efecto de la cocaína (0, 10, 50 y 1000µM) en cultivos de hepatocitos. Identificación de  hepatocitos en apoptosis (Zaragoza 2000)[Hoechst 33258]

REGENERACIÓN HEPATOCELULAR POSTNECRÓTICA,

parámetros de división celular:

α-fetoproteína, ploidia y distribución del DNA

en las fases del ciclo celular.

L12

Corte de hígado de rata en regeneración postnecrótica a las 48 horas de administración de una dosis subletal de tioacetamida. La figura muestra en el centro un hepatocito en proceso de división (Hematoxilina eosina) Dolores  Sarrión, Tesis Doctoral 1996

HÍGADO GRASO

OBTENIDO POR ADMINISTRACIÓN DE DIETA GRASA Y ETANOL A RATAS

 
           L13                  L14                L15
                   CONTROL                                DIETA GRASA                     DIETA GRASA + ETANOL
 

Efecto de la dieta grasa y el etanol sobre el acúmulo de grasa en hígado

(Santos-Ruiz MR, Tesis Doctoral 1979

ENVEJECIMIENTO

Metabolismo de fármacos y xenobióticos. Especies reactivas de oxígeno generadas por el metabolismo de fármacos en ratas envejecidas.

Influencia de la edad sobre la necrosis, apoptosis,  y regeneración hepática inducida por fármacos (tioacetamida).

Proteínas del estrés y hepatotoxicidad:

HSPs y metalotioneína

Influencia del gadolínio y clodronato,

inhibidores de la función de las células de Kupffer  y de los macrófagos circulantes  sobre los mecanismos de hepatotoxicidad inducida por tioacetamida.

Mecanismos de hepatotoxicidad del mercurio.

Metalotioneína y proteínas del estrés

 

TECNOLOGÍA UTILIZADA

 

Modelos de hepatotoxicidad in vivo en animales de experimentación

 (ratas y ratones) con thioacetamida y cocaína.

Modelos de citotoxicidad sobre hepatocitos de rata o

líneas celulares HEPG2 (ciclosporina)

Obtención de células hepáticas y cultivos celulares

Preparación de muestras para estudios morfológicos,  de citometía  de flujo y microscopía confocal

Obtención de fracciones subcelulares: citosólica, mitocondrial y microsomal

Actividades enzimáticas relacionadas con sistemas antioxidantes

Determinación  de proteínas por análisis de Western Blot

Determinación  de mRNA por análisis de Northern blot y RT-PCR.

Actividad de unión al DNA de factores de transcripción

(NFkB, AP1, HSF1) por EMSA (electrophoretic mobility shift assay),

PCR